pH值是細胞系高效生長的關鍵。

例如，大多數細胞系在pH 7.2-7.4時繁殖最好，成纖維細胞在pH 7.7時繁殖旺盛，轉化細胞系在pH 7左右時表現優異。為了跟蹤細胞生長過程中培養基pH值的變化，在某些情況下使用苯酚紅作為pH值的指示劑，pH值為7.4時為紅色。苯酚紅在酸性溶液中變為橙色(pH 7)和黃色(pH 6.5)，在堿性溶液中變為粉色(pH 7.6)和紫色(pH 7.8)。然而，在活細胞成像中常用的培養基配方避免使用酚紅，因為其光吸收消光系數高，可能造成背景噪音。

pH緩沖系統通常包含碳酸氫鈉和外部供應CO2。此外，合成的生物緩沖液，如HEPES，可用于短期研究時緩沖培養基。當細胞外溶液不能用HEPES緩沖時，CO2被輸送到系統，當與細胞外溶液接觸時分解為碳酸氫鹽。這就是為什么顯微鏡下的活細胞成像通常需要專門可調節大氣而設計的培養室。一般情況下，10-20mM HEPES緩沖液的濃度可以在無CO2存在時控制pH值，為碳酸氫鈉提供最佳的生長條件。

細胞系對氧氣的需求量變化很大。

哺乳動物細胞在體內呼吸通常需要氧氣，但在體外培養成種子細胞系或永生化后，通常可以替代厭氧糖酵解。但大多數活細胞成像實驗并不需要嚴格的O2調控。有趣的是，氧氣的消耗經常被用作一種策略，以減少通過與活性氧的反應而發生的光損傷。這一策略可能涉及氧氣消耗系統，如氧化酶或抗氧化劑，如維生素C，以限制自由基的損害。然而，在某些情況下，O2張力降低可能導致缺氧應激，這對細胞是有危險的。

大多數細胞系在260 ~ 320 mosM的滲透壓值范圍內高效生長。當添加HEPES來改變培養基組分時，監測培養基的滲透壓是很重要的。大多數成像室容納小體積，在培養基溫度較高時，由于蒸發作用，滲透壓會發生變化。在大多數情況下，顯微鏡有一個二氧化碳控制的孵育室，用于在37攝氏度下處理哺乳動物細胞。低滲培養基可以在培養皿中常規替代，以補償蒸發。也可以通過將培養基密封在一個開放的機油室或通過控制濕度來最小化蒸發。

在短期研究中應用大體積培養基可以避免由于蒸發而造成的滲透壓和O2的偏差。長期研究可采用加熱機組、加濕器孵育室、碳酸氫鹽緩沖系統相結合的方式對環境參數進行控制。

為了更好地解釋活體細胞成像實驗的結果，通常采用先進的寬視野和共聚焦顯微鏡技術。例如，細胞的生長和發育是在相位對比和差分干涉對比(DIC)顯微鏡下觀察的，但發育胚胎研究有時更傾向于在立體顯微鏡下觀察。另一方面，熒光技術被用來標記特定的細胞化合物，使它們在共聚焦顯微鏡下更容易觀察到。然而，活細胞成像系統被限制在一定的最佳條件下，以確保細胞保持在健康的狀態。